Film ini menceritakan tentang seorang tukang ledeng bernama Mario yang melakukan perjalanan melalui labirin bawah tanah. Ia akan berpetualang demi menyelamatkan saudara laki-lakinya yang ditangkap oleh musuh jahat. Chris Pratt meminjamkan suaranya untuk karakter kartun Italia Mario, bersama dengan Charlie Day sebagai saudara laki-lakinya, Luigi.
Anya Taylor-Joy berperan sebagai Princess Peach. Jack Black memerankan Bowser; Seth Rogen sebagai Donkey Kong’ dan Keegan-Michael Key sebagai Toad. Ada pun Kevin Michael Richardson menjadi Kamek, sedangkan Sebastian Maniscalco berperan sebagai Spike. Suara Mario dalam video game asli, Charles Martinet, juga akan mengisi karakter yang belum diungkapkan.